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              产品FAQ

              RT-PCR常见问题解答

              发布时间:2019-05-15 11:20:19 点击次数:

              Q:RNase H活性对反转录反应的影响?

              A:RNase H活性能够催化降解DNA/RNA 杂交体中的RNA。RNase H活性缺失避免了第一链cDNA 合成反应中DNA/RNA 杂交体中模板RNA被降解,从而保证第一链cDNA 的合成量和长度。


              Q:不同温度下的反转录反应有何差别?

              A:一般的反转录酶的适宜反应温度是42℃,但是对于某些GC含量高的基因或二级结构复杂的基因,在42℃不足以打开二级结构,使cDNA合成无法顺利进行。此时需要用耐高温的反转录酶,如TransScript II RT或TransScript -Uni RT,在高温 (≤55℃或≤65℃)条件下进行反转录以获得较好的结果。


              Q:RT-PCR后,无PCR产物的原因?

              A:在反转录反应前一定要电泳验证RNA的完整性,确认RNA没有降解。RNA不要保存时间过长,尽快进行反转录及PCR操作。


              Q:基因克隆测序后经常发生突变的原因?

              A:从cDNA进行基因克隆时,突变有可能发生在反转录过程,也可能发生在PCR过程中。一般用保真性高的Taq酶或者Pfu酶进行扩增,循环数不要太高;可通过增加模板量、减少循环数降低突变机率。为保证反转录时的保真性,请选择保真性高的反转录酶。


              Q:RT-PCR时模板一般使用多少?

              A:反转录反应体系为20μl时,用50 ng-5μg /5-500 ng Total RNA/mRNA进行反转录,RT-PCR用1/20-1/10 PCR体积 (2.5-5μl) 的反转录产物作为PCR模板 (50μl反应体系)


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